Identificación de bacterias que degradan petróleo y respuesta de la comunidad bacteriana a derrame de crudo en arenas del Golfo de México
Una porción significativa del petróleo del derrame de petróleo de Deepwater Horizon (DH) ocurrido en 2010 en el Golfo de México fue transportado a la costa, donde pudo tener graves consecuencias ecológicas y económicas. Con el fin de estudiar estas consecuencias a nivel microscópico y poder establecer controles ambientales y ecológicos, los autores de este trabajo se dedicaron a identificar y caracterizar las principales bacterias que degradan el petróleo y que podrían emplearse como degradadores modelo de hidrocarburos o como indicadores de contaminación, así como también analizaron la respuesta in situ de las comunidades bacterianas autóctonas a la contaminación producida por el derrame de petróleo.
Presentación
“Hydrocarbon-Degrading Bacteria and the Bacterial Community Response in Gulf of Mexico Beach Sands Impacted by the Deepwater Horizon Oil Spill” (“Las bacterias que degradan los hidrocarburos y la respuesta de la comunidad bacteriana en las arenas de las playas del Golfo de México afectadas por el derrame de petróleo de Deepwater Horizon”) es un artículo científico elaborado por Joel E. Kostka, Om Prakash, Will A. Overholt, Stefan J. Green, Gina Freyer, Andy Canion, Jonathan Delgardio, Nikita Norton, Terry C. Hazen y Markus Huettel, y publicado en la revista Applied and Environmental Microbiology en 2011, en el cual se identificó y caracterizó las principales bacterias que degradan el petróleo y que pueden emplearse como degradadores modelo de hidrocarburos o como indicadores de contaminación, así como también estudiaron la respuesta in situ de las comunidades bacterianas autóctonas a la contaminación producida por el derrame de petróleo de Deepwater Horizon en el Golfo de México, con el objetivo final de poder determinar los controles ambientales y ecológicos de la biodegradación de hidrocarburos en condiciones in situ en ambientes bénticos costeros.
El 20 de abril de 2010, la plataforma petrolífera Deepwater Horizon (DH), situada en aguas del Golfo de México a unos 66 km de las costas de Louisiana, sufrió una explosión que dejó 11 trabajadores muertos y causó un derrame de petróleo sin control durante 87 días, lo cual se convirtió en el peor desastre ambiental en la historia de Estados Unidos y en el más grave derrame accidental de crudo en el mundo.
Casi tres meses tardaron en sellar definitivamente el pozo desde donde salían sin control más de 50.000 barriles de crudo diarios. En total, se calcula que unos 795 millones de litros de fuel fueron derramados en el mar. La cantidad de petróleo se extendió por unos 149.000 km2 del Golfo y afectó a más de 2.000km de costa, desde Texas hasta Florida. Aunque los esfuerzos de limpieza fueron agresivos, una parte sustancial del petróleo permanece atrapada en los ecosistemas costeros, especialmente en las áreas bénticas.
Los sedimentos arenosos permeables cubren grandes áreas del lecho marino en el Golfo de México, incluidos los ecosistemas de playa. Las arenas marinas actúan como filtros biocatalíticos eficientes que desempeñan un papel importante en los ciclos biogeoquímicos del carbono y los nutrientes en las aguas poco profundas del Golfo. Estas arenas están cubiertas con biopelículas de comunidades microbianas muy diversas, donde la abundancia de bacterias en las arenas supera la del agua de mar suprayacente en órdenes de magnitud. El mejor intercambio de agua intersticial en arenas marinas altamente permeables, estimula el metabolismo microbiano a través de la disposición de sustratos de crecimiento y la eliminación de productos de desecho.
Por su parte, de manera similar a la descomposición de la materia orgánica natural mediada por microbios, la biodegradación por comunidades microbianas autóctonas, es el destino final de la mayoría de los hidrocarburos de petróleo que ingresan al medio ambiente marino. Los microorganismos que degradan hidrocarburos son ubicuos en el ambiente marino, estando incluso presentes (en baja abundancia) cuando el crudo está ausente; y, por otro lado, está demostrado que la biodegradación tiene éxito en la remediación natural de la contaminación por petróleo en costas donde predominan los sedimentos marinos permeables.
Aunque se suelen realizar pruebas de campo de biorremediación, existe escasez de información sobre las comunidades microbianas autóctonas que catalizan la degradación del petróleo; e incluso hay menos información sobre qué miembros de la comunidad microbiana están activos en la degradación de hidrocarburos, y no se han abordado específicamente los impactos de varios parámetros ambientales en el control de las actividades de los microorganismos autóctonos degradadores de hidrocarburos. Por lo tanto, falta la base teórica para comprender y predecir la dinámica de los microorganismos degradadores de petróleo in situ.
Asimismo, el riesgo de descarga accidental de petróleo en el medio ambiente marino seguirá siendo alto en el futuro previsible, ya que la mayor presión económica para acceder a nuevas reservas de petróleo en aguas marinas profundas requerirá tecnologías menos probadas. Y aunque las tecnologías para la extracción de petróleo han avanzado rápidamente en las últimas décadas, las estrategias para responder a los derrames de petróleo y evaluar los impactos ambientales de la contaminación por petróleo se han quedado atrás. Así pues, la comprensión de los impactos del petróleo en las comunidades microbianas autóctonas y la identificación de los grupos de bacterias que degradan el petróleo, son requisitos previos para dirigir la gestión y la limpieza de los ecosistemas de playa contaminados por petróleo. Por lo tanto, los objetivos de este estudio fueron identificar e investigar la ecofisiología de los taxones predominantes que degradan el petróleo que pueden servir como organismos modelo e indicadores microbianos de contaminación, y caracterizar la respuesta in situ de las comunidades bacterianas autóctonas a contaminación por petróleo en las arenas de las playas del Golfo de México.
Métodos
A continuación, se narran los métodos de trabajo que llevaron a cabo los científicos para realizar el estudio sobre las bacterias degradadoras de hidrocarburos y la comunidad de bacterias autóctonas tras el derrame de petróleo en el Golfo de México.
Sitio de recogida y descripción de la muestra
Este estudio se llevó a cabo en el municipio de Pensacola Beach, FL, donde, los días 2 de julio, 30 de julio y 1 de septiembre, se recolectó arena de la playa municipal (30°19.57N, 087°10.47W) que estuvo expuesta a la contaminación por petróleo pesado del derrame de Deepwater Horizon.
Cabe indicar que las arenas en la zona supramareal de la playa, donde se encontraron gruesas capas de petróleo enterradas, estaban secas sin agua intersticial extraíble y sin nutrientes disueltos.
Durante cada viaje, los investigadores tomaron testigos de sedimentos de 50cm de profundidad por duplicado de las zonas intermareal y supramareal. Seccionaron los núcleos asépticamente en intervalos de 10 cm en el sitio, los homogeneizaron y los submuestrearon en tubos cónicos estériles de 50ml (los núcleos del 2 de julio de 2010 los etiquetaron como OS55 a OS77, los núcleos del 30 de julio de 2010 como OS82 a OS91, y los núcleos del 1 septiembre de 2010 fueron etiquetados como OS291 a OS320).
Durante los últimos dos viajes de muestreo, excavaron una zanja de 10 por 1 por 1m perpendicular a la cara de la playa. Tomaron muestras a lo largo de la capa de petróleo visible que se extiende a lo largo de la zanja, y verticalmente a través de la capa de petróleo (las muestras del 30 de julio las etiquetaron como OS200 a OS244; y las muestras del 1 de septiembre, como OS248 a OS290).
Con el fin de llevar a cabo una extracción de ácido nucleico, todas las muestras se congelaron inmediatamente en hielo seco y se almacenaron a -80°C. Para el cultivo, las muestras se transportaron inmediatamente al laboratorio en hielo, se almacenaron a 4°C y se procesaron en unos pocos días.
También tomaron muestras de un segundo sitio de control, no afectado por la contaminación por petróleo, en St. George Island, FL (29°44′88.1″N, 084°42′58.6″W), antes de la explosión del DH. Tomaron muestras de los núcleos por triplicado, y el intervalo de superficie de 0 a 5cm se procesó igual que antes para su posterior análisis.
Asimismo, tomaron una muestra de aceite de origen del pozo DH que se usó para análisis químico y cultivo. Este petróleo se recolectó el 20 de mayo de 2010 a bordo del buque de perforación Discoverer Enterprise.
Análisis de la composición de hidrocarburos del petróleo
La contaminación por aceite se evaluó mediante examen visual en el campo de acuerdo con la siguiente escala: 0 para contaminación limpia o no visible, 1 para niveles bajos, 2 para medios y 3 para niveles altos de contaminación por aceite.
Un subconjunto de muestras de núcleo se extrajo ultrasónicamente y se sometió a análisis químico, utilizando técnicas de cromatografía de gases y espectrometría de masas (GC-MS).
Los hidrocarburos de petróleo totales se determinaron utilizando el método orgánico de petróleo residual de Florida (FL-PRO) en muestras de núcleo, así como en el petróleo fuente del pozo DH.
Además, se realizó un análisis más detallado de la composición de hidrocarburos del petróleo para el fuel de origen y las arenas de playa petroleadas que se evaluaron visualmente como que contenían niveles medios (2) o altos (3) de contaminación por petróleo.
Y los compuestos orgánicos semivolátiles (hidrocarburos aromáticos policíclicos, aromáticos, alifáticos) se determinaron mediante el método GC-MS SW846 8270C LL.
Recuento, enriquecimiento y aislamiento de bacterias degradadoras de petróleo
Las poblaciones bacterianas que degradan hidrocarburos se enumeraron mediante el ensayo del número más probable (MPN) de tres tubos, utilizando diluciones en serie de 10 veces de arena de playa en medio de cultivo, al que se añadió el fuel esterilizado como único donante de electrones y fuente de carbono hasta una concentración final de 0,2% (peso/vol).
En condiciones anaeróbicas, el medio se purgó con una mezcla de gases de 80% N2– 20% CO2 y se proporcionó nitrato como único aceptor de electrones a 3mM.
Para la enumeración en condiciones aeróbicas, el medio se dispensó en tubos de 16 x 150 mm que se taparon sin apretar y se agitaron continuamente a 150rpm en una mesa de agitación.
Los tubos se incubaron a temperatura ambiente durante 1 mes y el crecimiento bacteriano se controló mediante la turbidez del cultivo y el agotamiento del fuel añadido a intervalos regulares, en comparación con los controles esterilizados en autoclave.
De aquí aislaron cepas de bacterias que degradan petróleo de las diluciones positivas más altas de los enriquecimientos de MPN, así como de enriquecimientos paralelos realizados en volúmenes más grandes del medio de agua de mar artificial o con agua de mar esterilizada por filtración, añadido a arenas aceitadas junto a un 0,2% de fuel estéril.
Las bacterias desnitrificantes se aislaron en placas de agar del medio de agua de mar artificial equilibrado dentro de una cámara anaeróbica Coy con nitrato 20mM como único aceptor de electrones.
Caracterización fenotípica de cultivos puros de bacterias que degradan petróleo
Los aislamientos representativos se examinaron aún más en cuanto a la capacidad de degradación del crudo en condiciones aeróbicas, mediante la cuantificación del aceite residual en cultivos líquidos, utilizando métodos gravimétricos y espectrofotométricos.
La caracterización fisiológica inicial de aislados degradantes de hidrocarburos representativos se realizó mediante análisis fenotípico MicroArray (PM).
Extracción de ácidos nucleicos, huellas dactilares de ADN y análisis de secuencias de ARNr
El ADN genómico total se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN MoBio Powersoil (MoBio Laboratories, Carlsbad, CA) siguiendo el protocolo del fabricante.
La estructura de la comunidad bacteriana se evaluó inicialmente en extractos de ADN mediante la toma de huellas dactilares de la comunidad, utilizando el método automatizado de análisis de espaciador intergénico ribosomal (ARISA). Esta técnica, permitió la comparación rápida de una gran cantidad de muestras y ayudó a identificar muestras críticas para la secuenciación de piroetiquetas o pirotags.
Por su parte, el ARN total se extrajo de muestras de arena según el método de Chin et al., en donde el ADN contaminante se eliminó usando ADNasa I (Ambion, Austin, TX). Las reacciones de transcripción inversa para el ARNr se realizaron utilizando la transcriptasa inversa GoScript (Promega, Madison, WI) y el cebador inverso bacteriano general 1492R a 0,2μM.
Para la secuenciación de piroetiquetas, se enviaron ∼100ng de ADN extraído o ADNc, al Laboratorio de Investigación y Pruebas (Lubbock, TX), donde llevaron a cabo la pirosecuenciación de Amplicon FLX codificado con la etiqueta del gen del ARNr bacteriano, la amplificación por PCR, y las reacciones de secuenciación.
Después de la secuenciación, se eliminaron todos los fallos y residuos mediante un software personalizado. Las pirosecuencias se recortaron a 300 bases y las secuencias de menos de 300 bases se eliminaron del análisis posterior. Finalmente, los datos de secuencia se enviaron al archivo de lectura de secuencias del archivo europeo de nucleótidos, con el número de registro del estudio ERP000807.
Análisis de la composición de la comunidad bacteriana mediante software
El análisis de la secuencia se realizó a través de los paquetes de software QIIME y Primer6 (Primer-E; Lutton, Ivy Bridge, Reino Unido).
Las secuencias se agruparon en unidades taxonómicas operativas (OTU) con una identidad de secuencia del 97% mediante UCLUST, y las secuencias de referencia se seleccionaron mediante scripts en QIIME. Las OTU se clasificaron en QIIME, y las secuencias representativas se alinearon utilizando el algoritmo PyNAST, y la alineación se filtró para eliminar los espacios comunes. Con esto, se construyó un árbol filogenético de novo utilizando FastTree.
La diversidad beta de Jack-knifed se evaluó en QIIME. Se calculó la distancia de Bray-Curtis para cada tabla de abundancia de OTU enrarecida, y se calculó una distancia promedio por pares y una desviación estándar para cada par de muestras.
La matriz de distancia resultante se importó a Primer6 y se visualizó mediante un gráfico de escalado multidimensional no paramétrico (NMDS). Se utilizó el mismo método para generar un gráfico NMDS de una matriz de distancia UniFrac ponderada promediada.
Se realizó un análisis de la prueba de similitud en la matriz de distancias de Bray-Curtis para determinar si la agrupación de muestras por presencia de aceite era significativa.
Las especies indicadoras se identificaron mediante una prueba de similitud de porcentajes en Primer6.
Las muestras se agruparon en cinco tipos por ubicación (Pensacola y St. George Island), presencia de aceite y tipo de ácido nucleico.
Análisis moleculares cuantitativos para el seguimiento de bacterias totales y Alcanivorax
La cuantificación de genes de ARNr de subunidades pequeñas bacterianas (SSU ARNr), se realizó de acuerdo con el método de Nadkarni et al. Todas las reacciones se realizaron por triplicado y se analizaron utilizando un sistema de PCR en tiempo real ABI 7900HT Fast.
Tanto para los ensayos qPCR bacterianos como para los específicos de Alcanivorax, la cuantificación absoluta se realizó utilizando una curva estándar derivada de los productos de PCR del aislado de Alcanivorax dieselolei del presente estudio, generado por la amplificación génica casi completa de los genes SSU ARNr.
Los datos de qPCR se analizaron mediante el análisis de componentes principales, en el paquete de software Primer6.
Resultados del estudio de identificación de bacterias que degradan petróleo y la respuesta de la comunidad bacteriana al derrame del DH
Y a continuación, se muestran y explican los resultados obtenidos por los científicos.
Cambios en la composición de hidrocarburos
Se seleccionaron muestras representativas para el análisis de hidrocarburos a fin de cuantificar el alcance de la contaminación, verificar las observaciones visuales de la contaminación por petróleo y determinar qué fracciones de hidrocarburos de petróleo en las arenas de la playa se agotaron, en comparación con el petróleo original recolectado del pozo DH.
El análisis químico reveló concentraciones de hidrocarburos de petróleo que oscilan entre 3,1 y 4500mg/kg en las arenas de Pensacola Beach. Todas las muestras de arena de playa analizadas contenían concentraciones detectables de hidrocarburos de petróleo. En el rango más bajo de contaminación detectada por análisis químico (<10 mg/Kg), el aceite no se observó visualmente.
En la siguiente tabla se muestra una comparación resumida del análisis químico de los hidrocarburos de petróleo totales, la determinación cualitativa de la presencia de petróleo y la cuantificación molecular de la abundancia de bacterias en las arenas de Pensacola Beach, recolectadas del 2 de julio al 2 de septiembre de 2010.
Dos muestras de arena de playa impregnada de hidrocarburos se sometieron a un análisis químico detallado. En estas muestras, consideradas moderada o fuertemente contaminadas por observaciones visuales, las concentraciones totales de hidrocarburos de petróleo fueron de 1900 y 4500 mg/kg, respectivamente.
La comparación con la fuente de petróleo del pozo DH indicó una meteorización sustancial, en el sentido de que la mayoría de los compuestos de hidrocarburos detectables que permanecieron residían en las fracciones alifáticas (>C16) y aromáticas (>C35) de mayor peso molecular. Cuando se recogieron estas muestras el 1 de septiembre, aproximadamente 18 semanas después del inicio del derrame de DH, los hidrocarburos aromáticos policíclicos detectables y los compuestos alifáticos más ligeros (C6 a C16) y aromáticos (C8 a C21) se redujeron hasta cerca del límite de detección.
Se ha demostrado que los compuestos más pesados, como los alcanos más grandes (>C21), se degradan más lentamente que los correspondientes alcanos más ligeros (<C21). Por lo tanto, la proporción de alcanos más livianos (C6 a C16) a alcanos más pesados (C16 a C35), se usó como un sustituto químico para el proceso de biodegradación. La proporción observada en las arenas de playa contaminadas con petróleo (0,025 a 0,16) se redujo en 1 a 2 órdenes de magnitud, en comparación con la proporción observada en el petróleo fuente DH (2,79), tal y como puede verse en la siguiente tabla.
Recuento de bacterias degradadoras de petróleo
En las mismas muestras de arena para las que se realizó el análisis químico detallado anterior, los recuentos MPN de bacterias degradadoras de hidrocarburos cultivables en arenas contaminadas con petróleo excedieron los de las arenas “limpias” muestreadas en paralelo, de 3 a 4 órdenes de magnitud (2,4 × 106 a 9,3 × 106 células/ml).
La enumeración de bacterias con enfoques moleculares cuantitativos corroboró la evidencia basada en el cultivo.
Se determinaron las abundancias de genes de ARNr para muestras tomadas de todos los viajes de muestreo, lo que resultó en un conjunto de datos de 468 muestras de arena. Los recuentos de degradadores de hidrocarburos cultivables fueron paralelos a la cuantificación molecular de la abundancia de genes de ARNr bacteriano.
Así pues, en arenas aceitadas en las que se analizó el contenido de hidrocarburos, la abundancia de genes de ARNr bacteriano fue ∼10 veces mayor que en arena limpia (0,44 × 107 a 14,2 × 107g/l vs 0,024 × 107 a 1,57 × 107g/l).
Alcanivorax spp. no fue detectado por los métodos de qPCR en las arenas limpias utilizadas para la enumeración de MPN, pero sí se detectó en las arenas de Pensacola Beach sin contaminación visible por petróleo. Además, Alcanivorax fue más abundante en muestras de arena con contaminación visible por petróleo (0,27 × 107 a 2,77 × 107g/l) que en arenas sin contaminación visible (0,12 × 105 a 8,9 × 105g/l). Las diferencias en la abundancia total de bacterias y genes Alcanivorax entre arenas petroleadas y no petroleadas, son estadísticamente significativas, según lo evaluado.
Se realizó un análisis de componentes principales para investigar el efecto de la contaminación por aceite visible en la abundancia de bacterias, para el conjunto de datos de qPCR más grande de 468 muestras.
En la figura superior, las burbujas oscuras representan muestras visiblemente contaminadas con aceite, mientras que las claras indican muestras visiblemente limpias. El tamaño de la burbuja es relativo al número de copias del gen SSU ARNr bacteriano por gramo de arena. Como puede verse, la abundancia total del gen SSU ARNr bacteriano y la abundancia del gen SSU ARNr específico de Alcanivorax, covariaron y aumentaron con respecto a la contaminación por aceite visible. El porcentaje de abundancia de Alcanivorax no covaría con la abundancia del gen SSU ARNr de Alcanivorax, pero estuvo fuertemente asociado con la presencia de petróleo en el primer viaje de muestreo (2 de julio) y débilmente asociado con la contaminación por petróleo en los viajes posteriores.
El primer viaje de muestreo también se caracterizó por un aumento relativamente pequeño en la abundancia total del gen SSU ARNr bacteriano asociado con la contaminación por petróleo, en comparación con los viajes de muestreo posteriores.
Por otro lado, en análisis de regresión lineal de la abundancia de bacterias en general, en comparación con la abundancia de Alcanivorax spp. para cada viaje de muestreo, y observaciones respaldadas del análisis de componentes principales, indican que, durante el viaje de muestreo de julio, Alcanivorax spp. fue más abundante y se demostró que covaría con la abundancia de bacterias en general. En viajes de muestreo posteriores, la abundancia de Alcanivorax disminuyó y no covarió fuertemente con la abundancia bacteriana general. Así, inicialmente, la composición porcentual promedio de las copias del gen Alcanivorax comprendía el 10% del total de copias de genes bacterianos, y se redujo a <1% en los viajes de muestreo posteriores a septiembre de 2010, tal y como se recoge en la siguiente Figura.
Enriquecimiento y aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos
Las bacterias capaces de utilizar el petróleo como única fuente de energía y carbono, se aislaron de arenas de playa contaminadas con petróleo en condiciones aeróbicas y anaeróbicas.
El análisis de las secuencias del gen SSU rRNA bacteriano reveló que los aislamientos caracterizados pertenecen a 14 géneros de siete órdenes y cuatro clases dentro de tres filos (Proteobacteria, Firmicutes y Actinobacteria). La mayoría de los aislamientos se identificaron como miembros de cuatro órdenes (Oceanospirilalles, Alteromonadales, Vibrionales y Pseudomonadales) dentro de la clase Gammaproteobacteria. Se identificó un solo aislado de Alphaproteobacteria. Se aislaron dos organismos Gram-positivos de los filos Firmicutes y Actinobacteria.
Las secuencias del gen SSU ARNr de todos los aislamientos fueron muy similares a las recuperadas de las arenas aceitadas de Pensacola Beach. En particular, las secuencias del gen SSU rRNA de aislamientos de los géneros Alcanivorax, Marinobacter, Pseudoalteromonas y Pseudomonas compartieron una alta identidad de secuencia (> 97%) con secuencias recuperadas de arenas de playa aceitadas.
En la siguiente tabla se muestra la comparación de las secuencias del gen SSU ARNr de los aislados con la secuencia que muestra la mayor identidad de secuencia con él.
Y esta es la comparación filogenética de secuencias del gen SSU ARNr de aislados bacterianos que degradan el aceite (★) y secuencias recuperadas de arenas aceitadas de Pensacola Beach (negrita). Solo los linajes de Gammaproteobacteria se incluyen en el análisis.
Caracterización fenotípica de bacterias que degradan petróleo
Se analizaron cultivos puros de 5 de los 14 géneros (las secuencias del gen SSU ARNr muestran una alta identidad de secuencia con las de Alcanivorax dieselolei, Acinetobacter sp., Pseudidiomarina maritima, Marinobacter hydrochoclasticus y Vibrio hepatarius) para determinar el consumo de aceite en condiciones aeróbicas.
La capacidad de degradación del aceite se confirmó a partir de la cuantificación del aceite residual y el crecimiento concomitante como densidad óptica y proteína celular.
La cepa Vibrio consumió poco o nada de aceite, en comparación con los cultivos de control muertos y se observó un crecimiento mínimo. Por el contrario, todas las cepas restantes fueron capaces de llevar a cabo un rápido crecimiento aeróbico con aceite de origen como único sustrato de carbono y donante de electrones.
El análisis gravimétrico indicó que las cepas más similares a A. dieselolei y Acinetobacter sp., mostraron el mayor potencial de degradación del aceite, con un 93 y 90%, respectivamente, en comparación con los cultivos de control esterilizados en autoclave y sin inocular. Por su parte, las cepas más similares a M. hydrocarbonoclasticus y P. marítima, mostraron cantidades moderadas de degradación del aceite, con un 36 y 12%, respectivamente.
Asimismo, los resultados de los experimentos de cultivo en los que se cuantificó el consumo de aceite mediante espectrofotometría, confirmaron estos resultados mencionados del análisis gravimétrico.
Por otro lado, la caracterización fisiológica inicial se realizó para cinco de sus aislamientos (secuencias del gen SSU ARNr más similares a las de A. dieselolei, Acinetobacter sp., M. hydrocarbonclasticus, P. maritima y V. hepatarius), mediante análisis fenotípico MicroArray (PM). Las pruebas de PM incluyeron tolerancia a la sal, una amplia variedad de fuentes de carbono (alcoholes, aminas, aminoácidos, carbohidratos, ácidos carboxílicos, ésteres, ácidos grasos y polímeros) y formas inorgánicas y orgánicas de los principales nutrientes (N, P y S).
De acuerdo con su hábitat marino, todas las cepas en presencia de concentraciones de NaCl metabolizaron hasta el 10%. Además, los compuestos de Tween (sorbato de polioxietileno), que contienen restos de alquilo de cadena larga, fueron metabolizados por todas las cepas analizadas. Esto se considera un diagnóstico de la especificidad de sustrato de las bacterias marinas hacia el uso de hidrocarburos como fuente de carbono y energía.
Sin embargo, se observaron contrastes en el fenotipo entre las cepas de bacterias que degradan el petróleo que indican una especialización de nicho en el metabolismo del carbono y de los principales nutrientes. Así, las cepas de Vibrio, Acinetobacter y Marinobacter utilizaron una gama bastante amplia de sustratos de carbono; mientras que la cepa Alcanivorax utilizó relativamente pocas fuentes de carbono entre las probadas.
La siguiente tabla muestra un resumen de los taxones detectados en la abundancia relativa más alta en bibliotecas de pirosecuencias derivadas de ADN y ARN de arenas de playa en este estudio. Las abundancias notables de OTU se indican en negrita. Las bibliotecas de control son derivadas de ADN y ARN de la arena de St. George Island muestreadas antes del derrame de petróleo; y PB se refiere a arena de la playa de Pensacola.
Casi todos los grupos representados en su colección de cultivos de bacterias que degradan petróleo, se detectaron en bibliotecas de pirosecuencias de arenas de playa aceitadas.
Análisis cultivo-independiente de la estructura de la comunidad bacteriana en arenas de playa
La estructura de la comunidad bacteriana se evaluó inicialmente en extractos de ADN de 178 muestras de tres viajes de campo mediante la toma de huellas dactilares de la comunidad, utilizando el método automatizado de análisis de espaciador intergénico ribosomal (ARISA).
Se eligieron veintiséis muestras para la secuenciación pirotag o piroetiquetas de amplicones de SSU ARNr para representar cambios sustanciales en la estructura de la comunidad bacteriana. Los datos de pirosecuencia se analizaron utilizando un gráfico de escalado multidimensional no métrico (NMDS) de una matriz de distancia Bray-Curtis promediada, la cual está representada en la siguiente figura, donde las distancias revelan una respuesta pronunciada y uniforme a la contaminación por petróleo en las comunidades bacterianas totales y activas.
El patrón de agrupación de muestras en el espacio de ordenación, revela la respuesta de la comunidad a la presencia de petróleo, con las muestras más contaminadas (sombreado oscuro) distintas de las muestras limpias (sombreado claro). Las muestras prístinas o “limpias” se agrupan y son más distantes de las muestras aceitadas.
Las bibliotecas de pirosecuencias basadas en ARN, se agrupan con la biblioteca basada en ADN correspondiente, en la mayoría de los casos, y también están orientadas espacialmente con respecto a la presencia de aceite.
El tamaño de la burbuja es relativo al porcentaje de abundancia de OTU similares a Alcanivorax.
Se demostró que Alcanivorax spp. comprende la OTU más abundante en las bibliotecas de pirosecuencias, por lo tanto, la abundancia relativa de Alcanivorax OTU se superpone en el gráfico NMDS, lo que demuestra una fuerte covariación con la presencia de aceite.
Para obtener un representante de las bacterias metabólicamente activas presentes en las arenas de las playas, se generaron bibliotecas de pirosecuencias basadas en ARN y se compararon con bibliotecas basadas en ADN para cuatro muestras recolectadas el 2 de julio y seleccionadas para representar un rango en la contaminación visual por petróleo.
Esto reveló patrones similares en la composición de la comunidad agrupada a nivel de clase, especialmente en las muestras aceitadas. Se demostró que los miembros de Gammaproteobacteria y Alphaproteobacteria dominan las comunidades de arena de playa, independientemente de la presencia de petróleo.
Alphaproteobacteria y Actinobacteria muestran una representación proporcionalmente mayor en las bibliotecas basadas en ARN, en comparación con las basadas en ADN en todas las muestras. En la muestra con mayor cantidad de hidrocarburos, este aumento en la abundancia relativa de Alphaproteobacteria se debe, principalmente, a una sola OTU en la familia Rhodobacteraceae.
En la siguiente figura se muestra el análisis filogenético a nivel de filo y clase de bibliotecas de pirosecuencias bacterianas SSU ARNr, basadas en ARN y ADN, para muestras de arena de Pensacola Beach recolectadas el 2 de julio de 2010.
Discusión y Conclusión del estudio
El objetivo general de esta investigación fue determinar los controles ambientales y ecológicos de la biodegradación de hidrocarburos en condiciones in situ en ambientes bénticos costeros impactados por el derrame de petróleo DH en el Golfo de México.
Es probable que la capacidad de degradación del petróleo de las poblaciones microbianas en los sedimentos marinos, esté limitada por factores estresantes como la anoxia o la falta de nutrientes, así como por interacciones ecológicas como el mutualismo y el intercambio de biosurfactantes entre poblaciones bacterianas.
El conocimiento de la estructura de la comunidad bacteriana y la respuesta de los actores microbianos clave en ambientes contaminados con petróleo, brindan una primera mirada al potencial metabólico y los mecanismos fisiológicos que podrían impulsar la degradación de los hidrocarburos.
Así pues, en cuanto a la respuesta de las comunidades bacterianas autóctonas a la contaminación por petróleo en arenas marinas, se han reconocido más de 200 géneros de bacterias, algas y hongos (que abarcan más de 500 especies) como capaces de degradar hidrocarburos, sin embargo, resulta difícil predecir su dinámica y su respuesta in situ a la contaminación.
En este estudio, la enumeración molecular basada en cultivos de comunidades bacterianas, mostró un impacto distintivo del petróleo en el número total de bacterias y, específicamente, en la abundancia de degradadores de petróleo conocidos en las arenas de las playas del Golfo. No es sorprendente que la abundancia de bacterias aumentara a medida que el petróleo proporciona una fuente importante de carbono y electrones en un entorno marino que, de otro modo, carecería de nutrientes.
Con base en un extenso conjunto de datos moleculares de tres campañas de campo, mostraron que las bacterias en las arenas de Pensacola Beach eran, en promedio, de 2 a 4 órdenes de magnitud más abundantes en presencia de contaminación por petróleo; y los altos recuentos cultivables, así como los análisis basados en ARN, respaldan la premisa de que la mayoría de las bacterias en las arenas petrolíferas están activas. Estos resultados son consistentes con investigaciones de campo anteriores sobre playas petroleadas. Además, también vieron que la abundancia del grupo hidrocarbonoclástico conocido de Alcanivorax spp., aumentó en respuesta a la contaminación por aceite, y una comparación de la abundancia de ribosomas bacterianos en extractos de ARN, indicó que la abundancia de Alcanivorax era proporcionalmente mayor dentro de la comunidad bacteriana activa.
El petróleo comenzó a llegar a la costa de Pensacola Beach a principios de junio y observaron un florecimiento de Alcanivorax spp. y bacterias en general, a principios de julio, aproximadamente 4 semanas después del evento de derrame inicial. La abundancia máxima se observó en los cultivos de bacterias aeróbicas después de 1 a 2 semanas de incubación. Por lo tanto, estos resultados indican que las comunidades microbianas nativas en las arenas de las playas responden con bastante rapidez a la contaminación por petróleo, metabolizándolo para apoyar el crecimiento, a una tasa que está dentro de un factor de 2 a 4, en comparación con cultivos puros.
Junto con la observación de que las arenas petrolíferas se agotaron en hidrocarburos alifáticos y aromáticos de bajo peso molecular, la elevada abundancia de degradadores de hidrocarburos proporciona una indicación temprana de que la atenuación natural es una estrategia viable para la mitigación de la contaminación por petróleo en las arenas de Pensacola Beach.
Asimismo, aunque es probable que el metabolismo in situ de las bacterias que degradan el petróleo esté limitado por parámetros ambientales como la temperatura, el oxígeno y los nutrientes, así como el contenido de hidrocarburos del petróleo y la meteorización o dispersión del petróleo, las condiciones en las arenas subtropicales parecen favorecer una diversidad más amplia de degradadores de petróleo que podrían hacer innecesaria la bioestimulación. Así, las temperaturas en este ambiente siguen siendo óptimas para el crecimiento microbiano durante todo el verano, y el perfil de oxígeno indica que las arenas de Pensacola Beach se mantuvieron aeróbicas durante todo el período de estudio, con concentraciones de oxígeno en todas las profundidades muestreadas >90 % de la concentración de oxígeno en la superficie del sedimento.
El rápido crecimiento in situ que observaron después de 4 semanas, indica que las células microbianas tuvieron acceso al aceite. La mayoría de sus muestras de arena de playa se recolectaron en la zona supramareal y el espacio poroso intersticial de estas arenas no estaba saturado con agua de mar. Por lo tanto, concluyen que el crecimiento de las comunidades que degradan el petróleo probablemente estuvo limitado por la desecación y/o el agotamiento de nutrientes en las arenas de Pensacola Beach que estudiaron. La desecación exacerbaría el agotamiento de carbono y nutrientes, al cortar el suministro de sustratos disueltos de las aguas de marea inundantes.
Por otro lado, en corroboración de trabajos previos sobre arenas marinas en el Golfo de México, observaron que las arenas de Pensacola Beach contienen comunidades bacterianas muy diversas, en las que predominan miembros de Gammaproteobacteria y Alphaproteobacteria. La diversidad bacteriana fue mayor en las arenas de las playas, en comparación con las comunidades de bacterioplancton, pero no tanto como las comunidades bacterianas de los lodos o suelos marinos.
Simultáneamente con los cambios en la abundancia de bacterias, se observó un cambio pronunciado en la estructura de la comunidad bacteriana en las arenas de Pensacola Beach, en respuesta a la contaminación por petróleo DH. Estos resultados enfatizan que el petróleo incrustado ejerció una fuerte presión selectiva sobre la comunidad bacteriana de la arena, en concordancia con investigaciones anteriores. En este estudio, los cambios en la composición de la comunidad en las arenas de la playa en respuesta a la presencia de petróleo, se manifestaron a nivel de cepa a familia, pero se observó poco o ningún cambio a nivel de clase.
El presente estudio, junto con estudios anteriores, muestra que las gammaproteobacterias y, en menor medida, las alfaproteobacterias, predominan en las comunidades bacterianas de los ecosistemas de sedimentos marinos después de la exposición a los hidrocarburos del petróleo. Entre las Gammaproteobacteria en las arenas aceitadas de Pensacola Beach, los miembros del género Alcanivorax fueron los más abundantes. Dicho género se ha asociado con las primeras etapas de la degradación de los hidrocarburos (semanas o meses después del derrame) y se ha demostrado que utiliza hidrocarburos saturados, como alcanos de cadena lineal y ramificados. Otros miembros degradadores de hidrocarburos de la Gammaproteobacteria que se detectaron en el presente estudio (incluidos Acinetobacter, Marinobacter y Pseudomonas), aunque también tienden a ser menos abundantes al inicio de la degradación de hidrocarburos, son metabólicamente más versátiles que Alcanivorax y se ha demostrado que degradan hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), así como alcanos.
La evidencia del presente estudio también apunta a otros grupos microbianos como actores clave en la degradación del aceite. Las bibliotecas de pirosecuencias basadas en ARN respaldaron los resultados basados en ADN, ya que los miembros de la familia Rhodobacteraceae de Alphaproteobacteria se encontraban entre los filotipos más abundantes detectados en presencia de aceite. Un cambio hacia los grupos Rhodobacteraceae y Gram-positivos puede indicar que ha comenzado una sucesión en las arenas petrolíferas de Pensacola Beach, hacia grupos microbianos involucrados en la degradación de hidrocarburos de petróleo más recalcitrantes.
En estudios de campo de sedimentos marinos meteorizados que estaban empobrecidos en alcanos, los miembros de Alphaproteobacteria y Gram positivos fueron los grupos predominantes detectados. Las OTU que mostraron una alta identidad de secuencia con Sulfitobacter, fueron los miembros más abundantes de Rhodobacteraceae, los cuales asignaron hasta nivel de género en sus bibliotecas de pirosecuencias. Sulfitobacter es una bacteria oxidante de sulfito que ha sido aislada de una variedad de ambientes marinos. Por lo tanto, se deben explorar más a fondo las capacidades de Alphaproteobacteria y Sulfitobacter para degradar compuestos específicos del petróleo.
Por otra parte, con respecto al aislamiento, identificación y caracterización de modelos de bacterias que degradan petróleo, la evidencia de los enfoques basados en cultivos corroboró los resultados de los análisis moleculares independientes de cultivo. Por un lado, aislaron organismos de varios géneros bacterianos degradadores de petróleo bien conocidos (Alcanivorax, Marinobacter, Pseudomonas, Acinetobacter, Bacillus y Microbulbifer) que se detectaron en abundancia en las arenas petroleadas de Pensacola Beach. Los 24 aislamientos se examinaron inicialmente en medios mínimos con aceite como única fuente de carbono y electrones, evaluando así su potencial para degradar el aceite. Y por otro lado, vieron que la mayoría de las cepas de las arenas aceitadas de Pensacola Beach mostraron una alta identidad de secuencia del gen SSU ARNr con aislamientos previamente cultivados en hábitats marinos o salinos que estaban contaminados con hidrocarburos de petróleo. Se demostró que todos estos organismos degradan los hidrocarburos del petróleo en cultivos puros en el presente estudio o en otros, o se detectaron en ambientes marinos contaminados con petróleo.
Se ha demostrado que las bacterias del género Alcanivorax y otros miembros de la Gammaproteobacteria aisladas en el presente estudio, degradan los alcanos en cultivo puro. Representantes de al menos seis de las especies que aislaron (Acinetobacter sp., Bacillus sp., Labrenzia sp., Microbacterium sp., M. hydrocarbonoclasticus, P. pachastrellae y P. stutzeri) se han relacionado con la degradación de PAH en cultivo puro, y aunque todavía no se ha demostrado que las especies de Vibrio representadas en el presente estudio degraden el aceite en cultivo puro, se ha encontrado que algunos vibrios metabolizan hidrocarburos, incluidos los PAH. Estos resultados concuerdan, en general, con estudios de cultivo previos de estos taxones hidrocarbonoclásticos.
Entre las OTU que podrían clasificarse a nivel de género, los grupos Alcanivorax y Marinobacter mostraron la mayor abundancia relativa entre los degradadores de hidrocarburos conocidos en sus bibliotecas de pirosecuencias y estuvieron bien representados entre los aislados. Marinobacter es un taxón degradador de hidrocarburos metabólicamente versátil, capaz de utilizar una amplia gama de sustratos de carbono, incluidos alifáticos y PAH; por el contrario, se cree que las 15 especies descritas del grupo Alcanivorax son altamente especializadas, con A. dieselolei catalogada como una “bacteria hidrocarbonoclástica obligada” (OHCB) que es capaz de utilizar una gama muy estrecha de sustratos de carbono. El aislado de este trabajo, con una identidad de secuencia del 100% (en 850 bases) con A. dieselolei (AB453732), mostró el rango más estrecho de utilización de sustrato de carbono entre las cepas que probaron. Sin embargo, los resultados del presente estudio y otros, indican que es posible que sea necesario reconsiderar la designación de OHCB y que la secuenciación del genoma será esencial para verificar la ausencia de vías metabólicas.
Dos filotipos diferentes de Alcanivorax spp. eran abundantes en las bibliotecas de pirosecuencias, y trabajos anteriores han demostrado que es probable que la fisiología de Alcanivorax sea específica de la cepa.
Al igual que con otros gremios funcionales de bacterias, la taxonomía de los degradadores de hidrocarburos está evolucionando rápidamente, con lo que muchas especies no han sido válidamente descritas. De las que se han descrito formalmente, el fenotipo de la mayoría de las cepas se ha caracterizado en gran medida mediante pruebas de Biolog. Las pruebas biológicas son efectivas para encontrar rangos y para probar muchas cepas a la vez, como se ha hecho aquí. Sin embargo, estas deben considerarse como preliminares y requieren verificación con el tamizaje fisiológico tradicional en cultivo puro.
La hipótesis final de los autores de este estudio es que Alcanivorax spp. de las Gammaproteobacteria son indicadores microbianos eficaces o centinelas de las primeras etapas de la degradación de los hidrocarburos del petróleo en las arenas de las playas del Golfo cuando abundan los componentes más reactivos, como los n-alcanos, mientras que los miembros de las Alphaproteobacteria (Labrenzia y Rhodobacteraceae) y los grupos Gram-positivos (Bacillus y Microbacterium) pueden usarse como centinelas para las últimas etapas de degradación, cuando predominan los compuestos de hidrocarburos de petróleo más recalcitrantes, como los PAH.
Además, los investigadores proporcionan una serie de cultivos puros de estos grupos que pueden usarse como organismos modelo para investigar la ecología fisiológica de los degradadores de hidrocarburos en los hábitats bentónicos del Golfo de México. Se necesitan más estudios para delinear el papel específico de cada uno de estos grupos en la degradación de hidrocarburos en playas contaminadas.
En conclusión, la contaminación por petróleo del derrame de DH tuvo un profundo impacto en la abundancia y composición de la comunidad de bacterias autóctonas en las arenas de las playas del Golfo de México. Y el aumento cuantitativo en las secuencias de genes bacterianos, el aumento de la abundancia relativa de taxones conocidos que degradan el petróleo y el aislamiento de cultivos puros que degradan el petróleo de muchos de los mismos taxones, confirmaron la fuerte respuesta selectiva de las comunidades bacterianas autóctonas en las arenas de Pensacola Beach a la presencia de petróleo del derrame de petróleo DH. Miembros de Gammaproteobacteria (Alcanivorax, Marinobacter) y Alphaproteobacteria (Rhodobacteraceae) pueden ser actores clave en degradación del aceite allí.
Una mayor comprensión de la ecofisiología de los degradadores de hidrocarburos será crucial para descubrir los controles in situ de la degradación del petróleo y para el desarrollo de mejores estrategias de mitigación de los derrames de petróleo. A través del aislamiento de organismos modelo, las pruebas fisiológicas de los aislados y la secuenciación del genoma, se puede confirmar y comprender la actividad, el potencial fisiológico y la distribución ambiental de los degradadores de hidrocarburos.
Fuente de este artículo
Este artículo fue publicado originalmente en la revista Applied and Environmental Microbiology, bajo la referencia: Kostka JE, Prakash O, Overholt WA, Green SJ, Freyer G, Canion A, Delgardio J, Norton N, Hazen TC, Huettel M. Hydrocarbon-degrading bacteria and the bacterial community response in gulf of Mexico beach sands impacted by the deepwater horizon oil spill. Appl Environ Microbiol. 2011 Nov;77(22):7962-74. doi: 10.1128/AEM.05402-11. Epub 2011 Sep 23. PMID: 21948834; PMCID: PMC3208977; y el cual está disponible con acceso libre en la propia web de la revista Applied and Environmental Microbiology, así como también en la web del NCBI (National Center for Biotechnology Information).
